腦片膜片鉗實驗方法

腦片膜片鉗選擇海馬是中樞神經系統研究中應用較為廣泛標本之一。其原因有以下幾點：1、海馬與腦的其它部位相對隔離，較易剝離，且剝離后受到的損傷較小；2、海馬具有高度分化的片層結構，一方面，海馬神經環路在片層中的分布有一定的空間規律，如錐體細胞胞體分布在錐體細胞層，而雪氏側支突觸分布于輻射層，且海馬中存在一個三突觸聯系的回路，即穿通纖維-齒狀回顆粒細胞層、苔狀纖維-CA3區錐體細胞層、雪氏側支-CA1區錐體細胞層等，因此，在海馬中可以較準確地記錄到特定神經元或突觸的反應；另一方面，這種板層結構有利于解釋在某一部位記錄到的細胞外場電位的意義。這些都使海馬成為腦片膜片鉗電生理學研究的理想標本。本文對海馬腦片膜片鉗的操作規程及注意事項總結如下。

一、海馬腦片膜片鉗的制備

       腦片制備中，海馬分離應在斷頭后10分鐘內完成，5~6分鐘為宜。在分離海馬時，還應注意不要扭轉或撕扯海馬，更不要損傷海馬。分離海馬的速度和質量是保證海馬腦片制備成功的關鍵所在。

       評價腦片活性簡單的方法是記錄腦片上的群峰。在一個狀態良好的腦片上記錄到的群峰在一個很寬的刺激強度范圍內始終是單峰的。出現多個群峰往往提示抑制性突觸功能已受損，這是腦片早的病理生理學改變。如果僅存在突觸前纖維群峰(Fiber Volley, FV)，或FV峰大于突觸后反應，這提示腦片活性極差，有活性的突觸已所剩無幾，為激發突觸反應需要更多的突觸前纖維參與，需中止實驗。在活性較好的腦片中，FV峰幾乎探測不到，或遠遠小于突觸后反應。

       有時會莫名其妙地出現一些問題，突觸標本中突觸后神經元看上去狀態良好，但做了很多天甚至幾周都沒有得到有用的數據。在這種情況下，須要耐心地思考失敗的原因，并設法解決。首先，應該檢查溶液，用其它實驗室制備的標本或更換實驗動物。對于腦片的制備而言，切片機出現的機械故障會損壞腦片的質量。總之，在實驗的全過程中能盡量注意每一個細節問題，出現問題后反復嘗試，實驗就會容易起來。

二、海馬腦片膜片鉗記錄

1、將刺激電極放置在含突觸前纖維腦片區域附近

       在突觸傳遞的研究中，應該同時記錄突觸前和突觸后神經元的電信號，雖然，并不是所有突觸前神經元胞體的動作電位均可傳導至突觸 (Vincent, 1996)。由于在突觸前和突觸后兩個神經元上同時做膜片鉗記錄較困難，因此，需要用其它的方法來誘發突觸前動作電位的發放。用刺激電極可在單個或多個突觸前細胞或軸突誘發動作電位。另外，還可以用局部施加神經遞質的方法來誘導動作電位，如用短促的壓力、離子電泳或籠鎖谷氨酸光解等方法將谷氨酸加到突觸前胞體或軸突上，可以誘導出多個動作電位。

       用電極刺激 在神經元培養皿中，可以用連接了電源(通常是膜片鉗放大器)的微電極直接刺激突觸前神經元。在這種情況下，通常需要用負壓吸引使突觸前的細胞貼緊刺激電極，防止刺激電流的逸出。通過膜片鉗放大器給脈沖刺激的優點是，它可以記錄到突觸前細胞被激活的胞外電信號(Role, 1987)。從培養的神經元和腦片上找到有突觸聯系的一對神經元是很困難的，但在神經元培養中有單個神經元的Autapic突觸就會方便許多。

       可以用腦片膜片鉗電極或尖端較細的一對鎢電極給突觸前軸突纖維施加電壓脈沖。用電極刺激可將Ag/AgCl電極置于孵育槽中與其構成一電流回路。刺激電流一定要與膜片鉗放大器記錄電路隔離開，以防止刺激電流漏入記錄電極中，而使刺激尾跡變得很大。為此，施加刺激需要一個未接地的隔離器。隔離器可以用外界脈沖刺激或計算機來控制。另外，還需要將刺激尾跡縮小到最小，以排除其對突觸信號起始段的干擾。為達到該目的，需將刺激電路的回路電極置于合適的位置或用膜片鉗放大器提高串聯電阻補償的效率。

       刺激電極的位置通常將刺激微電極或刺激電極置于突觸前軸突通過的部位。但有時突觸前軸突在制備腦片時即被去除。如果腦片制備時局部神經環路被破壞，實驗中就很難成功地記錄到突觸后電流。實際上，切腦片的角度是保存局部神經環路最重要的因素之一，合適的角度既可使突觸后神經元保存完好，也可保留部分較長的突觸前纖維用于電刺激。用胞外電極刺激激活的神經纖維較多，而且，每次刺激激活的纖維數目也會不同。如果實驗目的是將不同的傳導通路分開，那么，必須要證明兩個刺激電極激活的纖維各不相同。